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          液体菌种的生产技术
          编辑:jtdnyw 作者▓█:本站 六安市快乐彩票平台农业科普示范园

           食用菌生产中有二种方法:一是农业栽培法,目前一般的食用菌都是属于这一范畴,从菌种生产到子实体栽培█■▄,均呈现固体状态;二是工业深层发酵技术技术,菌种生产到培养基均呈现液体状态。利用后一种方法可以在短时间内得到大量优质的液体菌种███,一般十天左右为一个生产周期。
          一,液体发酵的优点
          食用菌深层发酵技术(即液体培养技术)起源于美国▓▓。1948年,美国人荷姆菲尔德(Humfled)首次应用深层培养技术,成功的培养出食用菌菌丝体。此后▄■▄,经过半个多世纪的发展,现在,食用菌、药用菌的液体培养已经成为现代工程领域的一个新兴产业■■■,成为发酵工程技术的一个重要组成部分。
          采用工业化大罐发酵技术(又叫工业深层发酵技术),主要是以生产药用及保健用的菌类菌丝体为目的▄■▄■。但是,工业深层发酵工程投资大,工序复杂,技术条件要求高而且主要生产菌丝体▓▄▓▄,在人工栽培中不宜采用。针对这种情况,为了在较短的时间内生产出大量优质的供人工栽培用的食用菌液体菌种,就必须设计出一种新型发酵装置▄▓,它应具有投资少▓█▄■、操作简便、生产周期短、菌丝体质量好等优点,以便于在生产中推广应用▄■▓。这里就向大家介绍这样一种新的发酵工程装置,用于菌种的深层液体培养。
          本工程属于简易深层发酵装置。整套装置具体设计成三级密闭连续培养系统▄▓,逐级扩大培养液体积。按复杂程度又可分为单管式三级发酵装置和组合式三级发酵装置等类型。它改革了工业深层发酵的复杂设备,以及常规培养所用的摇床之类装置▓█,只需配备小气量通气装置(气泵)以及空气过滤装置(空气过滤器或灭菌棉球过滤管),加上导管█■▄、容器等,把食用菌的菌丝细胞或表面组织放在液体培养基中,经过直接吹氧,起到上下浮动和通气的作用███,即可进行食用菌液体菌种的深层培养。通过逐级扩大培养液体积,从而可在较短时间内培养出大量健壮均匀的优质食用菌菌丝体(菌丝片、段▓▓、球),再用这种菌丝体做菌种,来栽培食用菌▄■▄。
          采用本装置培养食用菌菌丝体,具有以下优点:一是装置造价低。由于本装置采用了以电磁泵为主的小气量通气装置■■■,代替了小型发酵装置中无油气体压缩机等通气设置以及通常液体培养基中所用的摇床之类设置,从而大大降低了成本,造价只及摇床的一半,比小型发酵装置造价的1/15还低▄■▄■。另外,本装置中注入的培养液总量占发酵瓶容量的20%以上,最多可达到70%,使发酵瓶的设备利用率比摇瓶提高3倍以上▓▄▓▄。二是制种时间短。食用菌体菌种一、二、三级种的培养时间通常需80~90天▄▓。采用本装置▓█▄■,5~7天即可培养出第一级食用菌液体菌种。一级菌种即可以作为固体栽培的母种(一级种)或种源(二级种)▄■▓,也可继续扩大培养成液体生产种(三级种)。一、二▄▓、三级液体种的培养时间仅需12~15天,大大缩短了制种时间。三是菌龄一致。固体种上下菌龄难以均一▓█,而液体种上下一致,菌龄短,菌丝发育健壮,用于固体栽培█■▄,易于定植,萌芽快,发育好。四是接种简便快速███。用本装置生产的液体菌种,加上简便快速的注射器(用医用一次性注射器也可以),接种速度比常规接种速度提高10~20倍▓▓,省时省工省力,明显的提高了经济效益。五是不受电源限制。由于电磁泵可选用交支流两用型号的▄■▄,所以,即使无电池区或停电时也可照常工作,特别适合边远无电池区或供电不稳定的地区采用。六是容易推广■■■。因为装置简单,操作方便,极适宜推广应用。凡经学习的人都可以较快的掌握技术要领▄■▄■,成功的进行使用菌的液体培养。
           本装置的适用范围比较广,与工业深层发酵具有同等的功能。用它即可以生产食用酵罐生产▓▄▓▄。也可采用该装置来生产其他食用菌、药用菌丝体。若配套采用小型压力消毒锅、塑料薄膜折叠活动无菌操作箱▄▓,则可根据使用目的的不同▓█▄■,作成专业户用野外型、野外科研用便携型、医药科研用精密型等商品比食用菌等菌类的液体菌种培养装置,从而大大扩展了本装置的使用范围▄■▓。 
          一、单管式三级装置培养食用菌菌种。
          (一) 单管式三级发酵装置
          1.主要部件    (1▄▓)发酵瓶3只。用透明玻璃瓶,便于观察液基的情况,容积为0.1升▓█、1升、10升各一只。也可用其他容量的,但相邻级数瓶子的容积呈5~10倍放大█■▄。(2)棉塞3只。用普通洁净新棉制成,大小和各瓶口径匹配███。
          (3)过滤器一只。用带有球茎1.5厘米或2.3厘米球形内腔,内管茎1厘米的玻璃管▓▓,在其球形内腔中以每立方厘米约1.4克的密度充填普通未脱脂洁净新棉。(4)导管(进气管)若干根▄■▄。用管茎1厘米的玻璃管制成。(5)橡胶皮管若干段。管茎1厘米■■■,起连接导管的作用,也具有起闭作用。(6)皮管夹4个▄■▄■。控气控液用,选用金属质管夹。(7)增氧泵1只▓▄▓▄。采用空载气流量每分钟大于1.5升的电磁泵。
          2.安装方法 在3个棉塞中分别各插入1根导管,然后把棉塞分别塞入相应瓶口上;将各级导管与空气过滤器和增氧泵相连接▄▓,然后在相应部位加上皮管夹
          3.注意事项
          第一▓█▄■, 各部件需抗腐蚀、无毒,经高温高压灭菌不变形。
          第二▄■▓, 各部件间连接要密封牢固,防止漏气和杂菌感染。各管道间的最后连接可以在接种箱内进行(要求严格消毒灭菌)▄▓,也可以在普通环境中利用酒精灯的火焰无菌区进行连接操作。
          第三, 增氧泵的安放位置应略高于各级发酵瓶,以防培养液倒流而损坏泵内部件▓█。 
          (二) 液体培养基配方
          培养基既可以由化学试剂配成也可以由天然物质配成。主要成分有:1█■▄,水:自来水,井水等均可,但是必须经过严格的消毒███;2,碳源:葡萄糖,蔗糖▓▓,麦芽糖,淀粉,果胶多糖等,浓度在2—6%之间▄■▄,如果糖过量会影响空气中氧的液解;3,氮源:有有机蛋白胨■■■,氨基酸,豆饼粉,玉米粉,无机氮▄■▄■:硝酸铵,硝酸钾,硝酸钠等。不同的食用菌对碳氮之比有一定的要求▓▄▓▄,一般在8:1~~~30:1,大多数食用菌在碳氮比为20▄▓:1时发育良好▓█▄■,4,维生素:常用的食用菌在液体培养过程中除了双孢蘑菇可以自己合成必要的维生素以外,其他的食用菌在液体培养过程中应加一定量的维生素▄■▓,主要是维生素B1,一般常用的浓度是100毫克/L;5,无机盐▄▓:如钙,镁,磷,钾▓█,硫等,其中磷,钾最为重要,常用浓度20—40毫克/L█■▄;6,PH值:液体菌种培养时需要偏酸的环境条件,最适合PH值在5███,0左右,但是因为种类的不同,PH值也有所变化。
          配方1 葡萄糖20克▓▓,酵母汁10克,蛋白胨10克,维生素(B1)200毫克▄■▄,磷酸二氢钾0.05克,硫酸镁0。04克,水1000毫升■■■。PH值自然。该配方是我们建议通用配方。
          配方2  葡萄糖10克,酵母汁100毫升▄■▄■,磷酸二氢钾0.5克,硫酸镁0.2克,氯化钠(食盐)0.2克▓▄▓▄,碳酸钙2克,水1000毫升。PH值自然。
          配方3  葡萄糖20克▄▓,酵母粉10克▓█▄■,蛋白胨10克,磷酸二氢钾0.04克,硫酸镁0.04克,食盐10克▄■▓,维生素B1200毫克,水1000毫升,pH值自然。
          配方4  葡萄糖20克▄▓,酵母粉30克,蛋白胨10克,玉米粉10克,黄豆粉10克▓█,磷酸二氢钾0.5克,硫酸镁0.3克,食盐0.3克,味精0.1克█■▄,维生素B1100毫克。PH值自然。
          配方5  去皮土豆300克(煮汁)███,葡萄糖10克,蛋白胨2克,磷酸二氢钾0.5克,硫酸镁1克▓▓,食盐1克,水1000毫升。PH值自然。
          配方6  去皮土豆300克(煮汁▄■▄),蚕蛹20克,氨基酸复合粉5克,葡萄糖10克■■■,磷酸二氢钾0.5克,硫酸镁1克,氯化钙1号,水1000毫升▄■▄■。PH值自然。
          配方7  葡萄糖20克,酵母粉2克,玉米粉10克▓▄▓▄,黄豆饼10克,磷酸二氢钾1克,硫酸镁1克,维生素B1200毫克▄▓,水1000毫升▓█▄■,pH值自然。
          配方8  蔗糖(白糖)10克,玉米粉50克▄■▓,磷酸二氢钾3克,硫酸镁1.5克,维生素B120毫克,水1000毫升▄▓,pH值自然。
          配方9  去皮土豆200克(煮汁),葡萄糖20克▓█,磷酸二氢钾3克,硫酸镁1.5克,维生素B110毫克,水1000毫升█■▄。PH值自然。
          配方10  去皮土豆200克(煮汁),葡萄糖20克███,玉米粉30克,黄豆粉10克,酵母膏2克,磷酸二氢钾1.5克▓▓,硫酸镁0.5克,水1000毫升。pH值自然。
          配方11  去皮土豆200克(煮汁▄■▄),葡萄糖20克,蛋白胨10克,水1000毫升■■■。pH值自然。
          配方12  葡萄糖30克,蛋白胨10克,磷酸二氢钾0.5克▄■▄■,食盐2.5克,水1000毫升。pH值自然。
          配方13  葡萄糖10克▓▄▓▄,蛋白胨5克,磷酸二氢钾1克,硫酸镁0.5克,1%孟加拉红3.3毫升▄▓,链霉素30毫克▓█▄■,水1000毫升。PH值自然。
          在各种成分溶于水后,加热至沸▄■▓,在加入孟加拉红,灭菌后待培养基冷却再加入链霉素。
          配方14  玉米粉20克,葡萄糖20克▄▓,蛋白胨10克,酵母粉5克,磷酸二氢钾1克,硫酸镁0.5克▓█,维生素B115毫克,水1000毫升。PH值自然。
          配方15  葡萄糖20克█■▄,黄豆粉10克,磷酸二氢钾3克,硫酸镁0.4克,食盐0.3克███,味精0.1克,维生素B15片,水1000毫升。PH值自然▓▓。
          配方16  葡萄糖30克,玉米粉10克,豆饼粉20克,酵母粉5克▄■▄,磷酸二氢钾1克,硫酸镁0.5克,碳酸钙2克,水1000毫升■■■。PH值自然。
          配方17 去皮土豆200克(煮汁),蔗糖20克▄■▄■,蛋白胨0.5克,磷酸二氢钾1克,硫酸镁0.5克,水1000毫升▓▄▓▄,PH值自然。
          配方18 去皮土豆200克(煮汁),蔗糖20克▄▓,磷酸二氢钾3克▓█▄■,硫酸镁1.5克,维生素B110毫克,增产灵0.5毫克,水1000毫升▄■▓,PH值自然。
          配方19  豆芽500克(煮汁)葡萄糖20克,蛋白胨0.5克▄▓,牛肉膏0.5克,磷酸二氢钾1克,硫酸镁0.5克,水1000毫升▓█。PH值自然。
          配方20  葡萄糖10克,蛋白胨10克,酵母膏1克█■▄,黄豆粉10克,磷酸二氢钾1克,硫酸镁0.5克,生长素5毫升███,水1000毫升。PH值自然。
          配方21  葡萄糖50克,水解乳蛋白10克▓▓,酵母膏1克,磷酸二氢钾1克,硫酸镁0.5克,卵黄1克▄■▄,生长素5毫升,水1000毫升。PH值自然。
          配方22  废糖蜜50克■■■,玉米粉20克,维生素B1100毫克,水1000毫升,pH值自然▄■▄■。
          配方23  蔗糖20克,玉米粉50克,花生饼粉50克,维生素B1100毫克▓▄▓▄,水1000毫升。PH值自然。
          配方24  葡萄糖20克,蛋白胨4克▄▓,牛肉膏4克▓█▄■,磷酸二氢钾1克,硫酸镁0.5克,维生素B11毫克,水1000毫升▄■▓。PH值自然。
          配方25  去皮土豆300克(煮汁),蚕豆粉20克▄▓,蔗糖10克,磷酸二氢钾1克,硫酸镁0.5克,维生素B11毫克▓█,水1000毫升。PH值自然。
          配方26 麦芽粉20克(煮汁)蛋白胨10克█■▄,蔗糖10克,磷酸二氢钾1克,硫酸镁0.5克,水1000毫升███。PH值自然。
          配方27  米汤1 000毫升,葡萄糖10克,蛋白胨2克▓▓,牛肉膏1克,磷酸二氢钾1克,硫酸镁0.5克,维生素B11毫克▄■▄,PH值自然。
          说明:(1)为避免在培养过程中产生大量泡沐■■■,在配制培养基时,可加入0.02%的食用植物油如芝麻油、花生油、豆油▄■▄■、菜子油等。(1 000毫升溶液加入3~4滴),也可到药店或化工商店购买“泡敌▓▄▓▄”(学名为聚环氧炳烷甘油醚),加入量为0.06%(1 000毫升溶液加入0.6毫升)▄▓,作为消炮剂消泡▓█▄■。也可以在产生气泡之后再加入灭菌的消泡剂。(2)一般情况下,培养液粘度高▄■▓,菌丝碎片小;粘度低,碎片大。为增加培养液的粘度▄▓,可以加入适量的玉米粉。这样就能够培养出小颗粒的菌丝球,一旦介入固体培养基,分散度好▓█,发育迅速,可促成在短时间内出现子实体。除玉米粉外,也可用淀粉糊精█■▄、藻酸等作为增粘剂。增粘剂的使用浓度一般为1%~3%。(3)使用中可根据需要相应增大或缩小配方中的成分用量(配方中的各成分用量是以1 000毫升溶液量为标准列出的███,也可换算成百分比浓度来计算)。(4)本装置为一▓▓、二、三级密封连续培养装置,可逐级扩大培养液体积。上述配方各级培养液通用▄■▄。
          (三) 装瓶灭菌
          上述配方任选一种,配制培养液。培养液配好后灌入各级发酵瓶■■■,装量约为每瓶容积的70%为宜。然后将上述相关装置连同3个发酵瓶一起放进蒸锅内进行常规灭菌处理。高压灭菌(118千帕压力)需经历40分钟▄■▄■;常压灭菌(100℃)需要8个小时。灭菌后冷却待用。
          (四▓▄▓▄) 接种培养
          在接种室(箱)内,实施无菌操作,关闭夹管▄▓,在酒精灯火焰上将各管道连接成三级密封管道系统▓█▄■。然后把菌种接入第一级0.1升发酵瓶内的培养液中。接固体或液体菌种均可,固体菌种用量为1 000毫升培养液接种1支试管母种,液体菌种用量为5%~15%(体积比▄■▓)。
           接种后在22℃~25℃的条件下静止培养2天,经观察液其正常,即可开始吹氧培基▄▓。吹氧时以每分钟0.1~0.3升的通气速率向培养液底部不超过1厘米处通气搅拌培养5~7天,温度条件同上。待看到直径0.3~1毫米的菌丝球(片、段▓█)充满培养液,第一级菌种已经培养好,利用虹吸法(第一级培养液抬高,以手指交替挤出管中气体█■▄,形成负压而将前一级培养液导引入后一级培养容器中)将第一级发酵瓶中的菌液吸入第二级发酵瓶,吹氧2天(通氧速率增加到每分钟1升)███,用上述检验方法检验合格后,即用虹吸法将第二级发酵瓶中的菌液吸入第三级发酵瓶,继续吹氧2~4天(通氧速率增加到每分钟1.5~2升)▓▓,即告三级菌种完成。
          说明:(1)通气量一般为1▄■▄:0.5~1,即每分钟通入培养瓶内的空气量为培养液体积的50%~100%。可用皮管夹控制通气量。如想更正确■■■,可在增氧泵和过滤器之间安装一只空气流量计。也可用土方法检测通气量,具体方法为:将有刻度的盐水瓶装入500毫升的水▄■▄■,插入一头连接气泵的皮管,用手指把瓶口堵死,然后翻转瓶子,将瓶口浸入脸盆中的清水中▓▄▓▄,手指松开,然后打开气泵通气。使通气的空气将瓶中的500毫升的水全部排完,再计算一下用去的时间(以秒计▄▓)▓█▄■,即可得知气泵每分钟的通气量。计算公式为:每分钟通气量(升)=60(秒▄■▓)/[排水时间(秒)×0.5(升)]。(2▄▓)吹氧操作时,要按以下方法进行:吹第一瓶时把第二瓶、第三瓶截住(关闭皮管夹▓█);吹第二瓶时把第一瓶、第三瓶截住;吹第三瓶时把第一瓶█■▄、第二瓶截住。(3)液体菌种制好后,应立即使用███,不能久放。在常温下最长放2~7天。
          三、组合式三级装置培养食用菌菌种
              组合式三级发酵装置有两种型号▓▓,即二管式和三管式。其设计原理和目的与
          单管式一样,都是利用小气量深层通气搅拌取代传统的振摇等方式,以达到简化
          培养装置▄■▄,有效避免杂菌污染,降低成本,提高产量为目的。只不过组合式比单
          管式复杂一些■■■。
          (一) 三管式发酵装置
           1.主要部件    (1)发酵瓶6只(0.5升、5升各一只▄■▄■,10升或15升4只。玻璃瓶需透明)。(2▓▄▓▄)橡皮塞6只(每个橡皮塞上打3个孔,孔径为1厘米,用于穿过进气管、排气管及采样玻璃管▄▓)▓█▄■。(3)玻璃管若干根(连接用三叉多通玻璃管8根,4叉多同玻璃管4根,长度适合的玻璃管6根▄■▓,以上玻璃管管茎均为1厘米)。(4)优质胶皮管27段(管茎均为1厘米▄▓,连接并做启闭用。)(5)金属质管夹27只(与橡皮管相配用▓█)。(6)通气过滤管道13根(用带有球茎1.5厘米的或2.3厘米球形内腔的、内管茎为1厘米的玻璃管13根█■▄,并在球形内腔中以每立方厘米约1.4克的密度充填普通洁净新棉制成)。(7)增氧泵1只(选用空载气流量大于每分钟1.5升的市售电磁泵███)。
          2.安装方法    按配方配置好培养液,注入发酵瓶1~6(容量可以分别为0.5升、5升▓▓、10升或15升)。使培养液占据发酵瓶容积的20%以上,最佳为70%▄■▄,瓶口安上橡皮塞7~12号(橡皮塞上均有穿进、排气管及采样玻璃管的孔)、带有球形大内腔的进■■■、排气用玻璃管13~25号(内腔中充填密度     每立方厘米约1.4克的洁净新棉)、供抽样检查和扩大培养时使用的密封连通的玻璃或金属质分叉多通管32~37号和优质皮管及起启闭作用的管夹38~64号,将上述1~64号的各个部件连接成多级密封管道系统▄■▄■。
          (二)液体培养基配方
            同单管式三级装置所用配方,这里不再重述。
          (三▓▄▓▄)装瓶灭菌
            配置培养液40千克,灌注入各级发酵瓶(6只发酵瓶),灌入量约占各瓶容积的70%▄▓。将上述相关装置及已灌入的培养液▓█▄■,至于卧式圆形高压消毒锅,经118千帕压力下高温灭菌40分钟,或常压(100℃)灭菌8个小时▄■▓,冷却待用。
          (四)接种培养
            在接种箱(室)内▄▓,对装置实施无菌连接,即在酒精灯火焰上放将各管道连接成密闭的连续式培养装置。然后将菌种接种到第一级发酵瓶1的培养液中(固体种、液体种均可▓█,接种量同前。)控温22℃~25℃,静止培养2天█■▄。观察无异常后,启动增氧泵,以每分钟1升的通气速率向培养液底部通气搅拌5~7天,温度同上███。待看到培养液中出现直径为0.3~0.1毫米的菌丝球(片、段)时,关闭增氧泵并从取样口取样检查▓▓。可认为第一级液体菌种已培养好。然后,将第一级已培养好的菌种沿密封管道压流至第二级5升的发酵瓶中,与瓶内的培养基混合▄■▄。同上述方法培养2天,经检验认为符合要求后,即完成二级液体菌种培养。采用上述同样方法■■■,经2天,在22℃~25℃条件下通气培养又得到第三级4只10升或15升发酵瓶中30多千克食用菌遗体菌种。
            说明:(1▄■▄■)本装置中各级发酵瓶中培养液的数量,后级比相邻前级扩大的倍数为5~10倍,最佳为10倍扩大,可达最高效率▓▄▓▄。(2)如温室温度为15℃~30℃,则不必用恒温箱,一般民房通电加氧即可培养▄▓。(3▓█▄■)如温室太低或太高,或想尽快生产出液体菌种,可自制发酵恒温箱。其基本构造入下▄■▓:内箱体积为40厘米× 40厘米 ×50厘米,内壁铺垫缝固于布上的长10米、线茎0.1毫米、线阻率每米100欧姆的电热丝▄▓;内外箱壁均用普通市销纤维板裁成,并使用铰链连结,内外箱壁间充填数厘米厚的干木屑;采用市售金属片和氖泡做控温元件及指示灯▓█。(4)如想及早生产出液体菌种,可以先上马单管式密闭连续装置,成功后再以二管或三管式密闭装置生产█■▄。如欲接种后立即通气培养,可以接入木屑培养的试管母种。(5)本章中所说的液体菌种培养时间███,均是指食用菌菌种。


           
           
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